反相高效液相色谱法测定烟叶中的游离氨基酸 　　氨基酸是烟草中的一类重要化学物质,在烟草调制、醇化或发酵、加工直至燃烧过程中,游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应,生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物,某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物,如苯甲醇、苯乙醇等.氨基酸含量与烟草制品的吃味有着密切的关系,氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物,对烟气香吃味产生不良影响,个别氨基酸还产生HCN等危害健康的烟气成分.一般说来,氨基酸含量太高,烟气辛辣、味苦、刺激性强烈；含量太低时烟气则平淡无味缺少丰满度.因此对氨基酸的分析是一项很有意义的工作,二十世纪60年代以来,国内外在这方面做了大量的工作[1-5]. 　　植物游离氨基酸样品的制备,国内外采用的提取剂和纯化方法各不相同.据文献报道[6-7],盐酸、不同浓度的乙醇溶液均可以用来提取植物组织中的游离氨基酸；提取液纯化则有用阳离子交换树脂、5%磺基水杨酸、活性炭或乙醚等方法.本实验对不同的提取方式和不同的纯化方法进行了对比研究,确定提取烟叶中游离氨基酸的较佳提取剂和纯化方法.提取、纯化后的样品,采用OPA、FMOC联合柱前衍生反相高效液相色谱法对烟叶中的游离氨基酸进行了测定.该方法使带氨基和亚氨基基团的氨基酸能够被同时测定,且得到较好的定性定量结果. 　　1实验 　　1.1仪器 　　Agilent公司HP1100型高效液相色谱仪(带可变波长紫外检测器和自动进样器),PE公司LambdaBio40紫外-可见分光光度计. 　　1.2试剂 　　正缬氨酸（Norvaline,内标）,OPA,FMOC,均为色谱纯,Agilent公司提供；硼酸缓冲溶液,Agilent公司提供； 　　醋酸钠(NaAc),分析纯,中国医药（集团）上海化学试剂公司；三乙胺（TEA）,四氢呋喃（THF）,乙腈（CH3CN）,甲醇(MeOH),均为色谱纯,Fisher公司试剂； 　　氨基酸标样包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）,均为生化试剂,中国医药（集团）上海化学试剂公司； 　　苯乙烯阳离子交换树脂（732型）,天津树脂厂. 　　1.3样品处理 　　将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重,粉碎,过80目筛,筛下物为实验用烟样粉末,置于广口瓶中备用.准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中,用一定浓度的乙醇溶液室温超声波提取半小时,过滤,相同浓度的乙醇溶液洗涤,再提取一次,合并后的滤液用阳离子交换柱洗脱,然后用95ml4mol/L氨水淋洗阳离子交换柱,淋洗液恒温浓缩至干,最后用3ml0.1mol/L稀盐酸溶液溶解浓缩物,将此溶液离心分离20min,0.45μm微孔滤膜过滤,加入浓度为5nmol/μ1的内标10μ1,定容至50ml,HP1100液相色谱仪进行氨基酸分析. 　　样品自动柱前衍生化：Agilent公司G1313A自动进样器进样.程序为：吸取5μl硼酸缓冲液,再吸取1μ1OPA试剂,洗针一次,吸取样品2μl,原位混合6次.吸取1μlFMOC试剂,洗针一次,原位混合3次,进样. 　　1.4色谱条件 　　色谱柱：HypersilAA-ODSC182.1×200mm 　　流动相A：1.36±0.025g醋酸钠,加入500ml纯水溶解,加90μl三乙胺,用1%醋酸调pH=7.20±0.05,再加入1.5ml四氢呋喃,混合均匀. 　　流动相B：1.36±0.025g醋酸钠,加入100ml纯水溶解,用1%醋酸调pH=7.20±0.05,将此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中,并混合均匀. 　　流速：0.45ml/min 　　柱温：40℃ 　　紫外检测波长:0～16min,338nm；16～25min,262nm 　　淋洗梯度：见表1 　　表1流动相的淋洗梯度表 　　Table1Thegradienttimetableofmobilephase 　　序列时间（min）流动相A（%）流动相B（%）流速（ml/min） 　　10.00100.00.00.450 　　215.5040.060.00.450 　　318.000.0100.00.450 　　421.000.0100.00.800 　　523.900.0100.00.800 　　624.000.0100.00.450 　　725.00100.00.00.450 　　1.5氮基酸的定性 　　用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法,通过对照保留时间进行定性,对氨基酸的出峰顺序加以确认. 　　1.6内标法定量 　　准确移取浓度为10pmol/μ1、25pmol/μ1、50pmol/μ1、100pmol/μ1、250pmol/μ1、500pmol/μ1、1000pmol/μ1的氨基酸混合标样100μl于带内衬管的样品瓶中,再加入250pmol/μ1内标溶液100μl,充分混合,液相色谱分析,仪器自动计算各氨基酸的标准曲线. 　　2结果与讨论 　　2.1萃取溶剂的比较 　　氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等,因此它们均可作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂,传统的方法是用乙醇和0.1mol/L的盐酸.实验发现,乙醇和0.1mol/L的盐酸萃取方法比较,提取出的烟叶中的游离氨基酸的总量变化不大,但用盐酸提取的样品分析时RSD%较大,平均8.51%,其中超过10%的有4个,甘氨酸的RSD%最大为20%；而用乙醇提取的样品分析时RSD%相对较小,平均5.12%,超过10%的只有1个.而且盐酸提取液过滤速度慢,需要30-40min,而乙醇提取液过滤只需10min左右；因此,本实验选择乙醇作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂. 　　2.2乙醇浓度的选择 　　选择五种不同浓度的乙醇溶液进行了烟样中游离氨基酸的提取,测定不同条件下提取液中游离氨基酸的总量,结果如图1.图中显示,在乙醇溶液浓度为80%时,烟样中总游离氨基酸的提取量最大.而且不同浓度下游离氨基酸的RSD%没有明显的变化,因此,选择80%的乙醇溶液来进行烟样中游离氨基酸的提取. 　　2.3不同纯化方法的确定 　　在最佳乙醇溶液浓度