【基因打靶技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术．结合图示回答问题．注：neor是新霉素抗性基因；tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟】
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问题描述：
基因打靶技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术．结合图示回答问题．
注：neor是新霉素抗性基因；tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡．
（1）将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA 片段都重组到___上，构建打靶载体（基因表达载体）．
（2）打靶载体测序验证正确后，利用___酶，将之线性化，以提高重组率．通过___技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组．
（3）为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入___．最后还需要通过___技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过___培养后，获得大量打靶成功的细胞．其中，暂时不用的细胞进行液氮（或冷冻）保存．
（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、___的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行___检查，确保其生下嵌合小鼠．这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因．如果某些小鼠的___（选填“体细胞”、“生殖细胞”）恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠．
刘宝友回答：
（1）分析题图可知，将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA 片段都重组到载体（或质粒）上，构建打靶载体（基因表达载体）．
（2）打靶载体测序验证正确后，利用限制酶，将之线性化，以提高重组率．通过显微注射技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组．
（3）neor是新霉素抗性基因，tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡，因此为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷．最后还需要通过DNA分子杂交技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过动物细胞（或克隆）培养后，获得大量打靶成功的细胞．其中，暂时不用的细胞进行液氮（或冷冻）保存．
（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同（或经同期发情）的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠．这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因．如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠．
故答案为：
（1）载体（或质粒）
（2）限制 显微注射
（3）新霉素和丙氧鸟苷 DNA分子杂交 动物细胞（或克隆）
（4）生理状态相同（或经同期发情） 妊娠 生殖细胞
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