（一）原理 　　亲和层析是一种吸附层析,抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合,而这种结合在一定的条件下又是可逆的.所以将抗原（或抗体）固相化后,就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上,借以与液相中的其他蛋白质分开,达到分离提纯的目的. 　　此法具有高效、快速、简便等优点. 　　（二）载体的基本要求和选择 　　理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水,但高度亲水；②惰性物质,非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好,具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好,最好为多孔的网状结构,使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用. 　　可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖.在这些载体中,皂土、玻璃微球等吸附能力弱,且不能防止非特异性吸附.纤维素的非特异性吸附强.聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体. 　　琼脂糖凝胶的优点是亲水性强,理化性质稳定,不受细菌和酶的作用,具有疏松的网状结构,在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时,对蛋白质几乎没有非特异性吸附.琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化,活化后性质稳定,能经受层析的各种条件,如0.1Mol/LNaOH或1Mol/LHCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理,不引起性质改变,故易于再生和反复使用. 　　琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose,含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B.因为Sepharose4B的结构比6B疏松,而吸附容量比2B大,所以4B应用最广. 　　（三）试剂与配制 　　1．Sepharose4B 　　2．CNBr（剧毒） 　　3．抗原或抗体 　　4．1Mol/LNaHCO3取NaHCO384.01g加水至1000ml. 　　5．0.1Mol/LNaHCO3 　　6．2Mol/LNaOH 　　7．0.01Mol/LpH7.4PBS 　　0.2Mol/LNa2HPO438.0ml 　　0.2Mol/LNa2HPO4162.0ml 　　NaCl32.76g 　　加水至4000ml. 　　8．0.1Mol/LpH2.8甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液甘氨酸15.01g加水至1000ml,取此液,加0.2Mol/LHCl84ml加水166ml共500ml. 　　9．7Mol/L尿素 　　10．0.2Mol/LNaHCO3,（含0.1Mol/LNaCI） 　　1Mol/LNaHCO3100.00ml 　　NaCl2.93g 　　加水至500.00ml. 　　（四）实验方法 　　1．琼脂糖活化 　　⑴取20mlSepharose4B放在布氏漏斗中抽干,加少量的0.1Mol/LpH9.0NaHCO3液洗涤,立即转入100ml烧杯中,冰浴置于磁力搅拌器上. 　　⑵在通风橱内称取2g溴化氰,加水20ml溶解,然后倒入琼脂糖中,小心滴加2Mol/LNaOH,使pH保持在11左右,反应10min.在1min~2min迅速调整pH为8.11.0维持10min. 　　⑶将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中,以冰水抽洗成中性,再迅速以250ml冷的0.1Mol/LpH9.0NaHCO3抽洗. 　　2．偶联蛋白20ml4B液体相当于一半的固相载体. 　　⑴事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/LpH9.0NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体). 　　⑵将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内,从抽洗到偶联）,4℃缓慢搅拌过夜,使蛋白与活化的琼脂结合. 　　3．装柱 　　⑴选柱：不宜过大,一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml. 　　⑵装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内,拧紧下口夹,让其下沉,数分钟后松开下口夹,使溶液约以1ml/min的速度流出. 　　⑶洗柱：以0.2Mol/LpH9.0NaHCO3（含0.1Mol/LNaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止. 　　收集全部的洗脱液,测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量,由此可计算偶联率. 　　4．吸附与解吸附 　　⑴按床体积1/10加样,浓度为1％～2%,缓慢加入待纯化的抗体（或抗原）,用0.01Mol/LpH7.4PBS液洗脱,流速为1ml/min,至洗出液OD280＜0.02为止. 　　⑵加0.1Mol/LpH2.4甘氨酸－HCl缓冲液,流速1ml/min,收集解吸附下来的成分,立即以1Mol/LNaHCO3中和,以免蛋白变性. 　　5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤,再用0.01Mol/LpH7.4PB液或生理盐水洗涤,平衡后,可继续使用.保存可加入0.02%NaN3于4℃保存.防止冷冻和干裂. 　　6．结果判定 　　⑴对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定. 　　⑵将纯度好的各管洗脱液合并,以生理盐水透析,然后浓缩或冻干保存.