新基因功能的研究方法设计实验,研究一新基因功能.简述流程.
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问题描述：
新基因功能的研究方法
设计实验,研究一新基因功能.简述流程.
李裕山回答：
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位,可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...）,提取RNA,反转录,做RT-PCR或realtimeRT-PCR,检测基因的表达情况/变化.
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法,检测基因的mRNA表达情况/变化.）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞,以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达.
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体,在适合的模式细胞中表达,在活细胞中观察蛋白的细胞定位.
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