污染物致突变性检测(Ames试验) 　　污染物对人体的潜在危害,引起人们的普遍关注.世界上已发展了百余种短期快速测试法,检测污染物的遗传毒性效应.B．N．Ames等经十余年努力,于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用.该法比较快速、简便、敏感、经济,且适用于测试混合物,反映多种污染物的综合效应.众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性,由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性,探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性,结合化学分析,追踪污染源,为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性,以防止维系生命的土壤受致突变物污染后,通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性,防止污染物经由大气,通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames试验研究化合物结构与致变性的关系,为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性,了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物,研究开发新的抗癌药等等. 　　一、目的和原理 　　鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌株,在含微量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到的微菌落.受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落.某些化学物质需经代谢活化才有致变作用,在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶①,可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足.鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关,故此法现广泛应用于致癌物的筛选. 　　二、步骤和方法 　　Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验. 　　1．菌株鉴定用于测试的菌株,需经基因型和生物学性状鉴定,符合要求才能投入使用. 　　目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102.鉴定前先进行增菌培养.为鉴定结果可靠,需同时培养野生型TV菌株,作为测试菌基因型之对照.增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基,接种后于37℃,100r／min振荡培养12h左右,细菌生长相为对数期末,含菌数应为1×109个／ml～2×109个／ml. 　　鉴定项目： 　　（1）脂多糖屏障丢失（rfa）用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液,在营养琼脂平板上分别划平行线,然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条,浸湿结晶紫溶液,贴放在平板上与各接种平行线垂直相交.盖好皿盖后倒置于37t温箱,培养24h后观察结果. 　　（2）R因子划线接种,贴放滤纸条及培养等均同上,唯滤纸条浸湿的药液不同,为氨苄青霉素钠溶液.TA102除pKM101外,还有pAQ1,载有抗四环素的基因,故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上. 　　（3）紫外线损伤修复缺陷（△uvrB）在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后,一半接种线用黑玻璃遮盖,另一半暴露于紫外光下8sec,然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿,防止可见光修复作用.培养同上. 　　（4）自发回变预先制备底平板；向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平.平皿倒置于37℃温箱培养48h. 　　（5）回变特性——诊断性试验上层软琼脂中除菌液外,还注入已知阳性物之溶液,需活化系统者并加入S9mix,余同上. 　　组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知. 　　2．斑点试验吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml,注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中,需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix,立即混匀,倾于底平板上,铺平冷凝.用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘,纸片浸湿受试物溶液,或直接取固态受试物,贴放于上层培养基的表面.同时做溶剂对照和阳性对照,分别贴放于平板上相应位置.平皿倒置于37℃温箱培养48h.在纸片外围长出密集菌落圈,为阳性；菌落散布,密度与自发回变相似,为阴性. 　　3．平板掺入试验将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中,需代谢活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix,混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝.同时做阴性和阳性对照,每种处理做3个平行.试样通常设4个～5个剂量.选择剂量范围开始应大些,有阳性或可疑阳性结果时,再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系.培养同上.同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比,为致变比（MR）.MR值≥2,且有剂量-反应关系,背景正常,则判为致突变阳性. 　　三、应用 　　1．斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质,大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均不适宜用此法.此法敏感性较差,主要是一种定性试验,适用于快速筛选大量受试化合物. 　　2．平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强弱.此法较斑点试验敏感,获阳性结果所需的剂量较低.点试获阳性结果的浓度用于掺入试验（每皿0.1ml）,往往出现抑（杀）菌作用. 　　3．致变作用迟缓或有抑菌作用的试样,培养时间延长至72h. 　　4．挥发性的液体和气体试样,可用干燥器内试验法进行测试. 　　5．目前,Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验,广泛应用于致突变化学物的初筛.但是,与今天快信息、高效率的社会要求相比,该试验程序还嫌繁琐,方法不够简便,有待于创建新的更为快速灵敏、简单易行的环境诱变剂短期生物测试法. 　　参考资料：中国水协设备网