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茚三酮显色问题本人做叶片中游离氨基酸的含量的测定,用的茚三酮法.但是将处理好的混合试剂用分光光度计比色的时候,发现数值会不断地下降,而且很厉害.这是什么原因?将试液放入试管水
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问题描述:

茚三酮显色问题

本人做叶片中游离氨基酸的含量的测定,用的茚三酮法.但是将处理好的混合试剂用分光光度计比色的时候,发现数值会不断地下降,而且很厉害.这是什么原因?将试液放入试管水浴,混合试液颜色会由浅黄慢慢变成深红紫色,取出后过一段时间待试液冷却后,颜色就会慢慢变浅,这是什么原因?哪位高人能解答?

所用试剂:

水合茚三酮试剂:取0.6g茚三酮置于烧杯中,加l5ml正丙醇,令其溶解,再加30ml正丁醇,60m1乙二醇,最后加入9mlpH5.40.2M的醋酸盐缓冲液。

PH值为5.5左右的醋酸-醋酸钠缓冲液。

0.3%抗坏血酸

简单说下过程,我测的是竹叶中的游离氨基酸,取材料0.1g,加3ml0.2M的醋酸迅速研磨,研磨后用滤纸过滤,用缓冲液定容到50毫升。开水水浴10分钟,,目的是沉淀样品中的蛋白质和氧化抗坏血酸.然后冷却。然后在另外的试管中加入3ml茚三酮,1ml缓冲液,1ml样液,0.1ml抗坏血酸,再水浴10分钟,冷却,稀释。580nm测吸光度!吸光度读数基本是1-2秒就减少1,10分钟内能从300多掉到100多。该取哪个读数?真不清楚中间是怎么个原因。是不是氨基酸浓度太低?因为感觉我做的空白对比读数下降的更快。另外我的样液水浴后是呈红葡萄酒那样的深红紫色,这是不是就是书上所谓的蓝紫色?

彭忠利回答:
  我觉得楼上的解答有个不妥之处:楼主说明了过程,无论是反应前试样的处理还是反应后的测定,都是冷却了的.所以,温度这方面应该不会影响测定了.而楼主担心的氨基酸浓度过低这种假设可能也不会很大,因为茚三酮的显色反应...
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