【采用基因同源重组法敲除基因可以研究某一基因的功能．同源重组在细胞中自然发生，原理如图1所示，交叉互换的位点必须发生在特定的同源序列中．为研究野生型小立碗藓的M基因是否与】
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问题描述：
采用基因同源重组法敲除基因可以研究某一基因的功能．同源重组在细胞中自然发生，原理如图1所示，交叉互换的位点必须发生在特定的同源序列中．为研究野生型小立碗藓的M基因是否与抗旱有关，研究人员制定了如下实验方案．请回答问题：
（1）测定M基因两侧的碱基序列．
（2）质粒pcDNA 3上有Neo基因（新霉素抗性基因）和限制酶SmaⅠ、Tth11Ⅰ和BsmⅠ的酶切位点，如图2所示．为了使该基因能与M基因发生同源重组，选用限制酶___将该基因从质粒上切下来，然后在该基因的两侧增加与基因M两侧相同___的碱基，构建具有抗性基因载体．
（3）用___法去除植物细胞壁，得到___，在等渗或微高渗溶液中用___做促溶剂，将Neo基因载体导入小立碗藓细胞内．
（4）在添加了___的培养基中培养植物细胞，在植物激素的作用下，植物细胞若能经历___等过程形成植株，则该植株___（有/没有）M基因．
（5）在___环境下种植该植株，与野生植株相比，如果该植株生长状况___，证明基因M与该植物的抗旱特征无关．
梅树朋回答：
（2）为了使该基因能与M基因发生同源重组，选用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ将该基因从质粒上切下来，然后在该基因的两侧增加与基因M两侧相同同源序列的碱基，构建具有抗性基因载体．
（3）去除植物细胞壁采用酶解法，用纤维素酶和果胶酶处理细胞，得到原生质体．在等渗或微高渗溶液中用PEG做促溶剂，将Neo基因载体导入小立碗藓细胞内．
（4）因为质粒pcDNA3上有Neo基因（新霉素抗性基因），故应在添加了新霉素的培养基中培养植物细胞，进行筛选．在植物激素的作用下，植物细胞若能经历脱分化、再分化等过程形成植株，则该植株没有M基因．
（5）该实验的目的是研究野生型小立碗藓的M基因是否与抗旱有关，故应在干旱环境下种植该植株，如果基因M与该植物的抗旱特征无关，则该植株生长状况与野生植株无明显差别．
故答案为：
（2）SmaⅠ和BsmⅠ同源序列
（3）酶解法 原生质体 PEG
（4）新霉素 脱分化、再分化 没有
（5）干旱 无显著差异
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