.样品处理粗分离纯化纯度鉴定2.柠檬酸钠用来防止血液凝固3.洗涤红细胞用的是低速短时间离心,用来去除杂蛋白。例如血浆中的血红蛋白。
1.样品处理①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白,采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞,然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆,将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的生理盐水,缓慢搅拌10min,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净。②血红蛋白的释放在蒸馏水和甲苯作用下,红细胞破裂释放出血红蛋白。注:加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜,有利于血红蛋白的释放和分离。2.粗分离①分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合溶液离心后,试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,是脂溶性物质的沉淀层,第3层是红色透明液体,这是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤,除去之溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。②透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的,透析12h。透析可以去除样品中的杂质,或用于更换样品的缓冲液。3.纯化调节缓冲液面:打开色谱柱下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝↓胶面平齐,关闭出口。加入蛋白质样品:用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后,∣打开下端出口,使样品渗入凝胶床内,等样品完全渗入凝胶层后,↓关闭出口。调节缓冲液面:加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度↓洗脱:连接缓冲液洗脱瓶,打开下端出口,进行洗脱。↓收集分装蛋白质:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集。