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质粒的构建过程希望能列出具体步骤
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问题描述:

质粒的构建过程

希望能列出具体步骤

程立新回答:
  因为高拷贝质粒稳定性低,而且给宿主细胞的压力大.   低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1~2次,而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10~200拷贝.   高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxedplasmid),独立于细菌细胞而自主复制;低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringentplasmid),它们的复制随细菌染色体的复制同步进行.   一般来说,外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高,但是当拷贝数很大时,拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在.这主要有两方面的原因:一方面,高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定,可能是由转录和翻译水平决定的;另一方面,高拷贝数的质粒往往很不稳定.由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关,因此对于重组蛋白的生产来说,质粒的拷贝数是一个非常重要的参数.   而且同一个细胞里一般不会同时有两种不同的质粒,这是质粒不相容性(plasmidincompatibility).在细菌细胞增殖过程中,其中必有一种会被逐渐排斥.所以要用纯化过的低拷贝质粒.   低拷贝在鸟枪法测序中很常用的.   随机测序战略又称鸟枪战略(shotgunstrategy),此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段,把这些DNA片段装入适当载体,建立亚克隆文库,从中随机挑取克隆片段.最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列.   1991年,HunkapillerT等首先应用鸟枪策略分析了小鼠T细胞受体和靶位的94.6kb基因组.1995年,美国私立基因组研究所(TIGR)所长VenterJC率先应用鸟枪策略对微生物基因组测序并取得了成功.同年完成的流感嗜血杆菌的序列测定完全是用shotgun策略直接进行的.该实验充分证明了此策略是分析微生物基因组全序列的有效策略之一.从1998年起,Venter领导的研究小组对人类全基因组采用鸟枪战略测序DNA提出大胆构想,计划在三个层次上进行测序,即对每一层次克隆的两端的称为序列标签联结子(STC)的500bp进行测序.第一个层次用BAC做载体,插入片段为150kb,并计划构建30万个BAC克隆,对每个BAC两端的500bp直接测序,获得10%的人类基因组序列,平均每5kb就有一个500bp序列标记.第二层次是用低拷贝质粒作载体,插入10kb片段,构建500万个克隆,对克隆两端的500bp测序,得到50亿个碱基序列.第三层次是用多拷贝质粒作载体,插入2kb片段,计划构建3000万个克隆,再对每个克隆的500个碱基直接测序,可获得300亿个碱基序列
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