枯草芽孢杆菌常用培养基配方:
1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂
枯草芽孢杆菌原生质体的制备
1培养枯草芽孢杆菌
取亲本菌株T4412、TT2新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中,36℃振荡培养14h,各取1mL菌液转接入装有20mL液体完全培养基的250mL锥形瓶中,36℃振荡培养3h,使细胞生长进入对数前期,各加入25u/mL青霉素,使其终浓度为0.3u/mL,继续振荡培养2h.
2.收集细胞
各取菌液10mL,4000r/min离心10min,弃上清液,将菌体悬浮于磷酸缓冲液中,离心.如此洗涤两次,将菌体悬浮10mLSMM中,每mL约含108~109活菌为宜.
3.总菌数测定
各取菌液0.5mL,用生理盐水稀释,取10-5、10-6、10-7各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基,36℃培养24h后计数.此为未经酶处理的总菌数.
4.脱壁
二株亲本菌株各取5mL菌悬液,加入5mL溶菌酶溶液,溶菌酶浓度为100ug/mL,混匀后于36℃水浴保温处理30min,定时取样,镜检观察原生质体形成情况,当95%以上细胞变成球状原生质体时,用4000r/min离心10min,弃上清液,用高渗缓冲液洗涤除酶,然后将原生质体悬浮于5mL高渗缓冲液中.立即进行剩余菌数的测定.
5.剩余菌数测定
取0.5mL上述原生质体悬液,用无菌水稀释,使原生质体裂解死亡,取10-2、10-3、10-4稀释液各0.1mL,涂布于完全培养基平板上,36℃培养24~48h,生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞.
计算酶处理后剩余细胞数,并分别计算二亲株的原生质体形成率.原生质体形成率=未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数.